喻新建主任细致讲解急性淋巴细胞白血病WHO分型及流式分析
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急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）是一种B或T细胞来源的淋巴母细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。异常增生的原始细胞在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵及骨髓外的组织。
主要表现为肝脾和淋巴结肿大、贫血、出血及继发感染等。ALL的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。
为了帮助大家更好地了解ALL免疫学分型以及流式分析在ALL诊疗中的应用，高博流式创新研究院系列培训课程第8期由来自高博诊断中心流式细胞研究室喻新建主任分享《ALL WHO分型及流式分析》精彩课程，具体内容如下。
一、关于ALL的一些事实
在课程伊始，喻新建主任介绍了ALL流行病学、发病特征和检测指标相关的基本信息，以便于我们对ALL有整体的了解。
简而言之，儿童比成人常见，B系比T系常见，B系比T系预后好。
大多数ALL属于B系，T-ALL只占儿童病例的10-15%和成人病例的25%。与B-ALL不同，T-ALL患者不能根据重现性细胞遗传学异常进行风险分层和治疗干预。B-ALL治疗效果好于T-ALL，但T-ALL预后随着使用强化化疗有显著改善。
ALL与淋巴母细胞淋巴瘤（LBL）的区分要点是根据原始细胞在骨髓或血液中的比例区分(25%以上诊断为ALL)。B-ALL多见于儿童，75%的病例小于6岁；B-LBL占LBLs的10%，年龄大多小于18岁。B-ALL常见于骨髓和外周血，髓外可见于中枢神经系统、肝脾淋巴结、睾丸；B-LBL最常见累及皮肤、软组织、骨、淋巴结，纵膈肿块少见。
T-ALL约占儿童ALL病例的15%，在青少年中比在年幼的儿童中更常见，在男性中更常见。T-ALL 约占成人 ALL 病例的 25%；T-LBL约占所有LBLs的85-90%，与对应的白血病一样，它最常见于青春期男性，但可以发生在任何年龄组。
T-ALL通常表现为高白细胞计数，并且通常伴有大的纵膈肿块或其他组织肿块，淋巴结和肝脾肿大很常见。T-LBL常表现为前纵膈肿块，常表现为快速生长，有时表现为呼吸急症，胸腔积液很常见。
对于给定的白细胞计数和肿瘤负荷，与B-ALL相比，T-ALL通常表现出正常骨髓造血功能的相对保留。T-ALL/LBL的淋巴母细胞在形态上与B-ALL/LBL的淋巴母细胞无法区分。不过ALL原始细胞的比例是以形态为准的。
与AML不同，对于确诊ALL所需的原始细胞比例没有公认的下限。但一般而言，当原始细胞小于 20% 时，应避免诊断为ALL。
二、B细胞和T细胞的分化过程
在讲到B细胞和T细胞的分化过程时，喻新建主任做了很形象的比喻：B细胞像女孩，一直养在家里深闺(骨髓)中成长；T细胞像男孩，从小就离家去远方的孤岛(胸腺)上修炼（图1~2）。
图1WHO B细胞的分化过程
图2 WHO T细胞的分化过程
三、ALL的WHO分型
ALL分型的演变过程
说到ALL WHO分型，可以用下面的时间轴（图3）和表格（表1）来概括一下演变历程。
图3ALL分型的演变
表12016年WHO ALL分型
流式免疫分型在白血病诊断中的作用
那么流式免疫分型在白血病诊断中发挥怎样的作用呢？
首先可以确定诊断，明确疾病是正常反应性、增生性还是肿瘤性；其次可以确定白血病细胞的数量和疾病系别；第三可以帮助判断分层，包括：和预后的关联、与治疗方案相关的危险分组以及疾病的累及范围，如有无中枢神经系统（CNS）累及等；此外，流式免疫分型还可以帮助确定治疗靶点，以及监测治疗效果(检测MRD)。
流式免疫分型判断异常细胞方法
对于ALL，和其它血液肿瘤一样，流式免疫分型判断异常细胞主要看以下几点：
1、抗原表达强度改变：过强，减弱或丢失2、跨系表达：同时表达其它系列标志3、抗原表达和成熟度不同步4、抗原表达均匀一致5、罕见细胞明显升高6、FSC和SSC的改变
流式免疫分型panel组成和ALL流式免疫分型基本抗体
ALL流式免疫分型的Panel主要由原始/幼稚细胞标记、系列特异标记、分化阶段标记、异常或跨系标记以及微小残留病（MRD）和/或靶向标记等部分组成。
高博诊断中心流式细胞实验室ALL流式免疫分型的基本抗体有：
B-ALL：CD19, CD20, CD22, cytoplasmic CD79a, CD34, CD38, CD10, CD58, CD81, CD123，CD13, CD33, CD45, TdT and HLA-DR
T-ALL：CD1a, CD2, CD3, cytoplasmic CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD33, CD34, CD45, CD56, CD38，CD117, MPO, TdT and CD99
国外一个比较有代表性的ALL Panel如下（表2）。
表2 ALL流式免疫分型panel示例(AIEOP-BFM协作组)
四、B-ALL的免疫表型及WHO2016亚型分类
在介绍了流式免疫分型在ALL中的应用基本知识后，喻新建主任分别从B-ALL和T-ALL两方面具体讲解了相关的免疫表型和亚型分类。
首先是B-ALL的免疫表型特点：
• B系标记：CD19，cCD79a，cCD22。单个都不特异，但组合或强表达，强烈支持诊断• 大多数表达：CD10，CD22，CD24，TdT• 不恒定：CD20，CD34• CD45弱或阴性• 可表达：CD13和CD33• 组织标本：病理一般用CD79a或PAX-5。但CD79a在T-ALL也会阳性，不特异。PAX-5更常采用• 顺便提一下，过渡型Pre-B可表达膜IgM， 轻链不表达• 克隆性的Ig轻链典型情况为阴性。阳性不排除B-ALL/LBL
特别关键的一点，是B-ALL细胞和正常B细胞前体的区别：
• Hematogones(正常B细胞前体)：表达CD10，连续，可重复• B-ALL细胞：抗体过表达或低表达。最常见的是CD10和CD58表达增加，CD38和CD45降低。少数情况下会出现CD10缺失，通常同时伴有CD24缺失和CD15表达。
一个有代表性的Hematogones流式图如下：
B-ALL常见异常表型见下表（表3）。
表3 B-ALL的异常表型
B-ALL/LBL亚型分类：
1、伴 t(9;22) BCL-ABL1
• 成人多于儿童，25% vs 2-4%• 表达：CD10, CD19, TdT• 常有CD13,CD33阳性• Kit（CD117）阴性• 成人患者CD25高度相关• BCL-ABL1者，罕见T-ALL
2、伴t(v; 11q23.3); KMT2A(MLL)重排
• 最常见于<1岁的婴儿• 成人随年龄而增加• 临床：高白细胞，>100x109/L, CNS累及• CD19+CD10-CD24- (Pro-B表型)• CD15+• NG2+
3、伴t(12;21)(p13.2;q22.1); ETV6-RUNX1(TEL-AML1)
• 不见于婴儿，常见于儿童，占年龄组的25%• 成人罕见• CD19+CD10+CD34+• 接近或完全缺失：CD9，CD20，CD66c• 常有CD13+
4、伴超二倍体
• 白血病细胞染色体数目>50，通常<66• 儿童常见，25%；成人不常见，7-8%• 表达CD19，CD10，CD34• CD45阴性
5、伴亚二倍体
• 白血病细胞染色体数目<46• CD10+CD19+。没有特别表型特点• 预后差
6、伴t(5;14)(q31.1;q32.1);IGH/IL3
• 罕见，1%，儿童成人均有报道• 可有嗜酸细胞增多
7、 t(1;19);TCF3-PBX1(E2A-PBX1)
• 儿童比成人常见，6%• Pre-B表型：CD19，CD10，cIgM,• CD9 strong, CD34-• 预后以前认为差，现在不确定，但易有CNS累及
下表归纳了上述亚型的部分特点（表4）。
表4 B-ALL亚型分类
（绿色表示预后较好，红色表示预后较差）
WHO 2016分类里新增了两个暂定(provisional)亚类：
8、BCR-ABL1样（图4）
• 占10-25%• 唐氏综合征，高频• CD19+CD10+，CRLF2高水平表达• 预后差
图4 BCR-ABL1样B-ALL的CRLF2表达
9、伴iAMP21：
• 21号染色体上RUNX1基因座的染色体内扩增• 常见于儿童，特别是大儿童。低白细胞类型。发生率2%左右• 表型无特殊• 预后相对较差• 使用RUNX1探针通过间期FISH很容易识别(诊断标准：至少5个RUNX1信号/细胞核)
五、T-ALL/LBL的免疫表型及WHO 2016亚型分类
在对T-ALL/LBL的免疫表型进行判断时，有以下几点需要注意：
• T-ALL/LBL 中的淋巴母细胞通常为 TdT 阳性，并不同程度地表达 CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7 和 CD8。
• CD7和胞浆CD3通常呈阳性，但只有CD3被认为是系别特异性的。
• CD4和CD8经常共表达，CD10可能呈阳性；然而，这些免疫表型对 T-ALL不是特异性的，因为CD4和CD8双阳性也可见于T细胞幼淋巴细胞白血病；外周T细胞淋巴瘤（最常见的血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤）中CD10可阳性。
• 除了TdT和CD34外，CD1a和CD99可有助于判明T淋巴细胞的前体性质。
• 在大约10%的病例中观察到CD79a阳性。髓系相关抗原 CD13和CD33之一或两者在19-32%的病例中表达。KIT (CD117)偶尔为阳性。
• CD56表达虽然是NK细胞的特征，但并不排除T细胞白血病。
• 根据表达的抗原，T-ALL/LBL先前被分为四个阶段：(1) pro-T/Tl，(2) pre-T/T-ll，(3)皮质 T/T-III和(4)髓质T/T-IV。许多以前归类为pro-T或pre-T的病例现在符合早期T细胞前体ALL(ETP-ALL)的标准。
那么作为WHO 2016新增的暂定亚型，ETP-ALL的免疫表型又是怎样的呢？
ETP-ALL是一种在儿童和成人中都发现的罕见肿瘤，约占儿童T-ALL病例的10-13%和成人 ALL病例的5-10%。它的免疫表型情况是：表达CD7，不表达CD8和CD1a；一个以上的髓系/干细胞标志物CD34、KIT (CD117)、HLA-DR、CD13、CD33、CD11b和CD65阳性；表达胞浆或(在极少数情况下表达)胞膜CD3；可能表达CD2和/或CD4；CD5常为阴性，当阳性时，须< 75%。
典型表型示例如下（图5）。有人建议将表达更亮或更均匀的CD5但满足ETP-ALL标准的白血病称为近似(near)ETP-ALL（图6）。
图5 ETP-ALL免疫表型示例
图6 near ETP-ALL免疫表型示例
六、ALL MRD的流式分析
喻主任指出，通过LAIP(leukemia-associated immunophenotype)和DFN(difference-from-normal)的综合集成方法，可以最大限度地提高多色流式细胞术（MFC）MRD分析的准确性。
随后喻主任为我们介绍了进行ALL MRD流式分析时的注意事项。
首先在ALL MRD的诊断标准上，定义>0.01%为阳性。如果一个实验室做不到0.01%的灵敏度，那么这个实验室报告的MRD阴性未必是真阴性。需要强调的是，由于LOD(Limit of detection)通常要求最少20个细胞（BM和PB，脑脊液CSF可降至10-15个），LOQ(Lower limit of quantification)要求最少50个细胞，所以达到10-4(0.01%)的LOD和LOQ需要分析的最少细胞数量分别为20万和50万。
其次在检测选用标本方面，在AML和B-ALL中，骨髓(BM)抽吸物中的MRD水平往往比外周血(PB)中的MRD水平高一个对数级以上，而对于T-ALL，MRD水平在BM和PB接近。一般来说，BM抽吸物通常是MRD分析的首选样本。此外，提交第一管，体积不超过2毫升进行MRD分析可以减少PB污染（稀释）。BM样品应使用乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素钠抗凝，及时处理(最好在收集后48小时内)。上样时则注意前后两管之间走一管鞘液以消除或最小化carryover污染。
第三，抗体组合通常包括CD34、CD38和CD45，可能包括TdT。对于B-ALL，还包括B细胞相关标志物(CD10、CD19、CD20、CD22、表面Ig和CD79a)和骨髓标志物(CD13和CD33)。为了在困难的情况下与hematogone的区分，也提出了其他标记，例如CD9、CD24、CD44、CD58、CD81和CD123。另外，CD81/CD58表达比率也可能有帮助。针对T-ALL MRD的panel通常包括CD1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD10、CD45和CD56。包含CD56有时有助于识别T-ALL MRD，因为正常的未成熟T细胞不表达CD56。加入cCD3和未成熟标志(CD34和TdT)也可以提高T-ALL MRD分析的准确性。识别T-ALL MRD理论上比B-ALL容易，因为正常胸腺细胞(幼稚T细胞)通常不在胸腺外发现。不过，反应性成熟T亚群可能出现CD4/CD8双阳性T细胞的扩增。
具体的MRD panel设计可以参考借鉴下面的例子：
COG (Children’s Oncology Group) panels：
B-ALLTube1: CD20 CD10 CD38 CD19 CD58 CD45Tube2: CD9 CD13/33 CD34 CD19 CD10 CD45
T-ALLTube1: CD16 cCD3 CD7-CD56 CD5 CD38 CD3 CD45Tube2: CD8 CD48 CD5 CD16+56 CD3 CD4 CD7 CD45
EuroFlow BCP-ALL MRD kit：
最后，在书写MRD报告内容时有专家建议以下几点：
1.MRD水平加上检测的LOD和LOQ；
2.白血病细胞的免疫表型；
3.细胞活力和样品质量(例如，潜在的血液稀释、细胞计数决定样品是否适合MRD检测)；
4.对应的正常细胞的比例(例如，评估B-ALL MRD的样本中hematogone的百分比)；
5.对于检测到MRD但低于LOQ的情况，可报告为: MRD低于LOQ，因此无法确定准确的定量；
6.对于检测到肿瘤细胞但低于验证LOD的情况，可报告为: 可见肿瘤细胞但低于LOD，因此其意义尚不确定，建议密切临床随访。
CAR-T后流式MRD分析的挑战
CAR-T 细胞治疗是一种非常有前景的肿瘤治疗方法，目前主要应用于血液肿瘤的治疗中。但同时，CAR-T治疗后会对流式MRD分析造成一定的挑战，主要体现在以下三点：
1.设门抗体的选择：系列标记的缺乏问题。CD19-CAR-T治疗后，新出现的肿瘤性B细胞克隆通常缺乏CD19的表达(30%~50%患者)。新的MRD检测方法会包括额外的B细胞设门标记，如CD22、CD24和/或CD79a；
2.CAR-T后肿瘤细胞的表型常会发生变化(Shift)；
3.细胞再生的影响。
CAR-T治疗后MRD检测的示例见下(图7~图9)。
图7 CD19-CAR-T后的流式MRD分析
图8 CD7-CAR-T前标本
图9 CD7-CAR-T后标本
喻主任提到，如果遇到CAR-T治疗后流式MRD分析不能很好的鉴别是否有异常细胞时，最好同时结合分子生物学检测(如白血病融合基因，二代测序法的TCR或Ig基因克隆性重排等)。
课程最后，喻主任展望了ALL MRD流式分析的发展方向。他指出，传统分析方法在未来可能会显得捉襟见肘，人工智能的应用将会对ALL MRD的鉴别带来极大的帮助。已经有流式学者在做这方面的工作。但同时他也指出，目前人工智能在流式诊断上的应用尚未成熟，未来需要各位同仁的不懈努力。
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