童春容主任：血液肿瘤基因变异检查的临床意义

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对血液肿瘤的诊断与分型，目前专家的共识是应采用MICM-PP的整合诊断方法，也就是联合形态学及细胞化学、免疫学、染色体、基因分析、组织病理、病原学来诊断与分型，以达到更全面准确的诊断、指导精确治疗的目的。

恶性肿瘤都是多种染色体和/或基因异常导致的。随着二代测序技术快速发展并用于临床，一次很快可以检测数百种甚至全基因测序，这样发现每个恶性肿瘤患者都有多种基因变异，包括基因丢失、新基因插入或被替代等。基因变异的筛查有以下临床意义，从而被大量应用。

一、帮助诊断血液肿瘤

一些血液肿瘤，尤其是骨髓增殖性肿瘤(MPN)、骨髓增生异常综合征(MDS)、MDS/MPN综合征等，没有特异性的免疫学、染色体或融合基因异常，在早期时主要表现为血液细胞轻度升高或降低，难以与再生障碍性贫血、类白血病反应等良性疾病鉴别。既往诊断主要靠排除多种疾病，并需要较长时间的观察才能诊断。

几乎所有恶性血液肿瘤都能检查到某种或多种基因变异，因此当有一些患者有以上血液肿瘤的临床表现及一些实验室特征时，相关基因变异阳性对这些疾病的诊断有重要意义，基因变异检查可明显提高恶性血液肿瘤诊断的准确率及速度。2016年世界卫生组织(WHO)将基因变异作为血液肿瘤的诊断及分类标准。

还有一些髓外血液肿瘤，由于组织标本少，其它方法难以有足够标本诊断；或治疗获得完全缓解后来到我院，怀疑既往的诊断。因此我们发展了用骨髓/血涂片、组织切片等少量标本做几百种基因变异检查的方法，对于这些患者可以用治疗前做其它检查留存的标本（骨髓涂片、血液涂片、组织切片等）来检测血液肿瘤的基因变异，从而帮助进一步确定血液肿瘤的诊断及预后，并帮助治疗选择。

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JAK2（包括V617F和Exon12）基因变异在髓系恶性肿瘤诊断中的价值。

JAK2基因变异可见于多种MPN及其它血液肿瘤。JAK2 V617F变异见于约95%的真性红细胞增多症（PV）, JAK2 Exon12变异见于2-5%的PV，实际上全部的PV患者都有JAK2的激活性变异。

JAK2 V617F变异见于50-60%的原发性血小板增多症(ET)或原发性骨髓纤维化（PMF），50-80%的伴铁粒幼红细胞及血小板增多的难治性贫血（RARS-T）有JAK2 V617F变异。

但是其它一些血液肿瘤也可伴 JAK2 V617F基因变异，如见于8%的慢性粒单核细胞白血病，还可偶见于少数急性髓性白血病（AML）、MDS、慢性髓性白血病(CML)。

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研究显示，70%的青少年型慢性粒单核细胞白血病（JMML）有累及GM-CSF(粒单细胞集落刺激因子)信号传导途径的变异，如NRAS、KRAS、PTPN11、CBL等。
Meggendorfer M等（2012）对275例CMML分析了SRSF2、ASXL1、CBL、EZH2、JAK2 V617F、KRAS、NRAS、RUNX1、TET2 基因变异。发现93% 的CMML至少有一种基因变异，47% (129/275)的患者有SRSF2基因变异，其中120例为SRSF2 Pro95变异。

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近年的研究发现以下基因变异常见于MDS: TET2、ASXL1、DNMT3A、EZH2、SRSF2、SF3B1、IDH1、IDH2、U2AF1、ZRSR2。

在MDS患者中，以下基因变异发生率分别为：TET2 20.5-25%，DNMT3A 3-13%，ASXL1 14.4-20.7%，EZH2 6.4-12%，IDH1/2 4-12%，SF3B1见于6-18% 非环形铁幼细胞性难治性贫血-MDS（RS-MDS）、57-75.3%的RS-MDS, SRSF2 1.5-11.6%, U2AF1 8-12%, ZRSR2 1.4-8.0%。U2AF1基因变异多见于ASXL1变异或20q-染色体异常的MDS患者。

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ASXL1基因变异见于MDS、CMML、AML 等髓系肿瘤患者，更多见于CMML；见于38-43%的MDS/MPN 综合征，2-10%的前列腺癌。


二、预后价值

临床指标、染色体、融合基因、免疫标志都具有良好的预后价值。染色体具有独立的预后价值。但是仍有一些患者用目前的预后指标不能准确预测目前治疗方法的治愈率。

如AML中仅40-50%患者有染色体异常，基因变异对这部分患者可进一步提供预后指标。

但临床医生要注意恶性肿瘤是多个基因变异引起的，每个患者可有多个基因变异，不同变异之间可以相互作用，因此分析基因变异时要综合判断。基因变异的预后意义还与变异的位点、变异频率有关，因此还要了解不同变异位点及其频率的意义。

2016年WHO首先将遗传易感性髓系肿瘤（髓系肿瘤携带天生或遗传容易患髓系肿瘤的基因变异）单独归类，因为这类患者多数需要移植，对不同遗传易感基因患者的移植方案也应该有所调整；而且对亲缘家属供者应该对这些遗传易感基因进行筛查，以选择更好的供者。

近年发现越来越多的血液肿瘤遗传易感基因及天生易感基因（患者在胚胎期就携带了容易患血液肿瘤的遗传易感基因），因此遗传易感基因也成为热点研究方向。

Elli Papaemanuil等(2016)在新英格兰杂志报道了对AML进行大病例基因变异的研究结果，他们研究了1540例AML患者的111种癌症基因变异、染色体及临床资料，以确定AML的基因变异价值；患者来自三个采用强化疗的多中心临床试验，一组为18-65岁，一组为18-61岁，一组为18-84岁；中位观察5.9年；发现了5234个驱动基因，累及76个基因或者区域；发现96%的患者至少有一个驱动基因，86%患者有≥2个驱动基因。

因此结合染色体、融合基因（FG）及基因变异，将 AML分为10多类（见下表），发现更多影响预后的基因变异，基因之间相互作用，对结果产生影响；患者白血病的驱动基因变异数量越多，总生存率（OS）越低，与初治时的年龄和白细胞计数无关；AML随着时间的发展，常伴随多个克隆同时存在，这说明AML是复杂的。



染色体、融合基因、不同基因变异的组合影响预后。以下一些图分别显示了它们相互作用结果。如AML如同时有TP53变异及亚二倍体染色体或者复杂染色体异常，几乎无长期生存的，比仅有单独一种异常的预后更差；同时携带ASXL1及SRSF2基因变异的预后也比仅有一种的差很多，几乎无长期生存的；同时携带MLL-PTD及FLT3-TKD变异预后很差；同时携带DNMT3A+IDH2或DNMT3A+NPM1+FLT3-ITD或DNMT3A+NPM1+NRAS预后很差等。







因此，2017年欧洲白血病网络(ELN)将基因变异纳入预后AML的预后分层指标。随后美国国家癌症网路（NCCN）也采纳了ELN的预后分次标准。下图是2019年NCCN对AML预后分层标准。



三、帮助选择治疗方案或途径

基因变异检测指导的靶向药越来越成为血液肿瘤的重要治疗方法。

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FLT3变异阳性的难治AML患者可用索拉菲尼（主要对FLT3-ITD变异有效）、舒尼替尼、杰瑞替尼、米朵妥林等靶向治疗药物暂时获得完全缓解或部分缓解。

目前，米多妥林联合化疗已经是FLT3变异AML的一线治疗方案。

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有KIT基因变异者用格列卫等酪氨酸激酶抑制剂(TKI)治疗有效，应用降低白血病负荷后再移植可提高移植的成功率。

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伴IDH基因变异的患者可从IDH抑制剂获益。美国FDA已经批准艾伏尼布（ivosidenib）单药治疗老年性IDH1变异的AML；恩地西平（enasidenib）用于治疗难治复发的IDH2变异的AML。


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DNA的甲基化异常者通过分离染色质与CpG岛甲基化的异常以灭活肿瘤抑制基因、激活原癌基因；表观基因异常通过基因的去甲基化或影响小RNA的机制导致恶性疾病的发生。

表观遗传学基因变异还可能是基因不稳定的原因，治疗后易诱发FLT3-ITD变异，导致白血病耐药复发（Wakita S等，2012）。

表观调节基因TET2、IDH1、IDH2、DNMT3A、ASXL1等变异，MLL基因变异可采用甲基化抑制剂(5氮杂胞苷、地西它滨)及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂治疗有效，尤其是TET2基因变异者用5氮杂胞苷疗效好。

目前维奈托克联合5氮杂胞苷已经是老年性AML的一线治疗方案。我们发现，维奈托克联合去甲基化药及其它靶向药，可能广泛用于多种血液肿瘤的治疗，使一些既往需要异基因造血干细胞移植的高危险性患者达到治愈。

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伴NRAS或KRAS基因变异的AML患者可以用曲美替尼或考比替尼等治疗，可从大剂量AraC化疗获益。

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以下基因变异可能用全反式维甲酸(ATRA)治疗获益:FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、MLL基因易位。

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伴JAK基因变异的血液肿瘤可从JAK基因拮抗剂治疗获益。


四、增加追踪微小残留
白血病（MRD）的指标

基因定量是最敏感的MRD监测指标，其敏感性可达到1/10万-1/100万，也就是说在十万个细胞中有一个恶性血液细胞都可能用基因定量检测出来。

我们多年的临床实践显示，用最敏感的实时定量PCR检测患者的白血病融合基因,如果在治疗后从阳性转为阴性，治愈率明显提高。

既往我们主要用多重巢氏PCR方法筛查急性白血病的融合基因，并定量阳性FG监测其疗效，但仅40%多的急性白血病有特异性融合基因，因此对大多数白血病患者难以用基因定量监测白血病。

由于融合基因检测的是RNA，我们不能回顾分析既往的标本。绝大多数血液肿瘤都有基因变异，治疗后可用10万层以上深度测序定量这些变异基因，可大大提高基因监测微小残留白血病的覆盖率，以帮助判断疗效，帮助治疗决策。

五、复发机制的探讨

最近一份研究对8例AML初诊及复发时的标本进行全基因组测序，发现有两种不同的复发形式：5/8例患者为：在初诊时有一个主要克隆，多个亚克隆，复发时某一亚克隆成为主要克隆，且携带有附加的基因变异；另3例是初诊时的克隆获得更多基因变异后复发。

遗传易感基因严重也是患者化疗后容易产生新的染色体异常或基因异常然后“复发”（实际上是新的血液肿瘤）的原因。

但是遗传易感基因是很多基因综合引起，需要检查很多基因综合判断。我们医院已经可以检查700种以上遗传易感基因，综合家系分析或家族史分析、既往疾病、毒物药物接触史综合判断遗传基因变异在发病中的重要性，以及是否需要异基因造血干细胞移植，帮助选择亲缘供者，制定移植预处理方案。




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